BÁO CÁO SINH HỌC PHÂN TỬ


ĐẶT VẤN ĐỀ

Toàn bộ ADN của tế bào, bao gồm tất cả gen và những vùng liên gen được gọi là bộ gen. Bộ gen người chứa khoảng 80.000 gen, nhưng những vùng mã hóa của gen này chiếm khoảng 3% của toàn bộ gen. Bộ gen của nấm chứa khoảng 6.000 gen. Bộ gen của một vài thực vật có nhiều trình tự lặp lại. Bộ gen của prokaryote rất nhỏ được chứa trong nhiễm sắc thể có dạng vòng, prokaryote cũng có thể có những gen nằm trong plasmid. Bộ gen của prokaryote không có intron và những trình tự lặp lại.

Hiểu được những thông tin chứa trong trình tự bộ gen là những thách thức lớn trong giai đoạn đầu của thế kỷ 21. Muốn nghiên cứu về bộ gen, kỹ thuật tinh chiết DNA là một trong những kĩ thuật sinh học phân tử đầu tiên vô cùng quan trọng góp phần cho sự thành công trong những bước tiếp theo.

Hiện nay có rất nhiều phương pháp đơn giản hơn, thời gian làm việc rút ngắn hơn tùy theo mục đích sử dụng DNA để làm gì, hoặc chiết xuất DNA từ loại mô nào, trên đối tượng gì.

Ở đây ta nghiên cứu việc ly trích DNA trên 3 nhóm đối tượng chính là thực vật, động vật và vi khuẩn với các đại điện của chúng là lá bưởi, tôm, E.Coli. 

NỘI DUNG

1.KIẾN THỨC CƠ SỞ

1.1/Chiết xuất và tinh sạch DNA

1.2.1/Nguyên tắc chung chiết xuất DNA

  Chuẩn bị mẫu

 

   Phá vở tế bào
Hòa tan DNA
Loại bỏ tạp chất ( protein, polysaccharide…)
     Tủa DNA
Rửa DNA
Làm khô
Kiểm tra chất lượng DNA

 1. Chuẩn bị  mẫu:

      - Đối với thực vật thường thu lấy mẫu lá, động vật thu lấy mô trên cơ thể, vi         khuẩn: nuôi vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy từ 15-16 giờ để tăng sinh., thường nuôi trong 16 giờ cho kết quả tốt nhất.

2. Phá vỡ tế bào:

      - Dùng phương pháp ly tâm để phá vỡ màng tế bào và phóng thích ADN trong nhân. Riêng mẫu lá thực vật, do còn có lớp vỏ cellulose bên ngoài, nên phải được nghiền trong nitơ lỏng, giúp làm cho vách cellulose trở nên giòn hơn, dễ vỡ hơn, đồng thời bảo vệ ADN phóng thích từ nhân không bị tiêu hủy bởi các protease trong tế bào. Ngoài ra, màng tế bào và màng nhân còn được phá vở bằng hỗn hợp chất tẩy (SDS – sodium dodecyl sulfate, sarcosyl) và proteinase. Các DNA sẽ được giải phóng ra môi trường. Các protein liên kết với DNA cũng tự bị phân hủy.

3. Hòa tan ADN:

      - Hòa tan DNA trong dung dịch đệm buffer TE (pH 8) giúp ADN không bị biến tính.

4. Loại bỏ  các thành phần không phải là  ADN:

      - Proteinase K: loại bỏ thành phần protein.

      - CTAB: loại bỏ polysaccharide và lipid.

      - Chloroform: phân tách và kéo các thành phần không phải là DNA xuống mặt dưới  dung dịch.

5. Tủa ADN:

      - Sử dụng ethanol 96% hoặc isoproanol ủ ở – 200C để tủa DNA trong dung dịch. Mục đích là thu nhận nucleic acid dưới dạng cô đặc và bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme.

6. Rửa DNA:

- DNA được rửa lại bằng ethanol 70% để loại bỏ các muối và các dấu vết isopropanol.

7. Làm khô:

- DNA sau khi rửa được làm khô bằng cách phơi ở nhiệt độ phòng qua đêm hay sấy khô. Mục đích tránh mẫu DNA còn chứa ethanol sẽ ảnh hưởng đến DNA tổng số.

8. Kiểm tra chất lượng DNA:

            Đo quang phổ

            Chạy điện di

1.2.2/Kiểm tra chất lượng DNA

Kiểm tra chất lượng DNA là bước cần thiết trong quy trình chiết xuất DNA.

Thí dụ:Số lượng và chất lượng DNA có thể ảnh hưởng đến kết quả của PCR vì một lượng DNA dư thừa có thể ức chế sự khuếch đại những đoạn DNA mong muốn.

Biết được nồng độ DNA sẽ dễ dàng tính toán được số lượng cần dùng của các loại enzyme cắt giới hạn để cắt DNA. Thông thường 1 unit enzyme cắt được 1 µg của DNA tinh khiết.

1.2.2.1/Đo quang phổ

Nguyên tắc:  

Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng của một chất ở một bước sóng xác định. Nucleic acid hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm do sự có mặt của base purine và pyrimidine. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm (OD260nm) của các mẫu cho phép xác định nồng độ nucleic acid trong mẫu.

                  Đơn vị OD260nm tương ứng nồng độ 50ng/ml cho một dung dịch ADN sợi đôi.

Do đó nồng độ ADN trong mẫu được tính theo công thức sau:
                           CADN (ng/ml) = OD260nm * 50 * Độ pha loãng

                  Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD ở 280 nm (OD280nm). Ở bước sóng này, các protein có mức hấp thụ cao nhất. Ngoài ra, các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm như các nucleic acid và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic acid. Một dung dịch nucleic acid được xem là sạch (không tạp nhiễm protein) khi tỷ số:

               OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1.8 – 2

                  Các bước đo OD:

                  Chuẩn bị mẫu DNA đo OD: Hoà 10ml dịch ADN cần đo vào 90ml nước khử ion vô trùng

                  Đo đối chứng:  Lấy 100ml nước khử ion vô trùng vào cuvet, đo ở bước sóng 260nm, 280nm.

                  Đo mẫu: Lấy 100ml mẫu DNA đã chuẩn bị ở trên vào cuvet, đo ở bước sóng 260nm, 280nm.

                  Đọc độ hấp thụ trên máy đo quang phổ ở bước sóng 260 nm, 280 nm. Xử lý số liệu theo công thức:

                 Nồng độ DNA sẽ là:    OD 260 *  50 ng/µl * độ pha loãng

1.2.2.3/Điện di Gel Agarose 

Nguyên tắc

Điện di gel agarose là phương pháp thông dụng, thích hợp dùng để tách rời các đoạn acide nucleic có kích thước từ 200bp đến 50kp.

Agarose là chất chiết xuất từ 1 loài rong biển, agarose có cấu trúc polymer thẳng, hiện nay người ta đã chế tạo được nhiều loại agarose đặc biệt để phân tích DNA, RNA như agarose tan ở nhiệt độ thấp như: low meeting agarose, metaphore agarose

 

Gel agarose  được đổ bằng cách đun agarose trong dung dịch đệm thích hợp cho đến khi có màu trắng trong và cho đặc lại bằng cách đổ vào khuôn và để nguội. Khi đặc lại agarose tạo nên mạng lưới mà kích thước của nó phụ thuộc nồng độ agarose và dung dịch đệm.

Khi nằm trong gel có pH >7 DNA sẽ tích điện âm, dưới tác dụng của điện trường thì DNA sẽ chạy về phía anode. Vận tốc di chuyển của DNA phụ thuộc vào các thông số sau:

  • Kích thước DNA: kích thước càng lớn thì DNA di chuyển càng chậm và ngược lại.
  • Nồng độ agarose: tùy kích thước DNA muốn phân tích mà ta chọn nồng độ agarose thích hợp. Kích thước DNA càng nhỏ thì nồng độ agarose phải càng lớn.
  • Kiến trúc DNA: với cùng kích thước, tùy kiến trúc: siêu xoắn, vòng hay thẳng mà tốc độ di chuyển của DNA khác nhau. Tốc dộ di chuyển cũng phụ thuộc vào dung dich đệm và lượng ethidium bromide. Ở đây chúng ta không nghiên cứu kỹ về vấn đề này.
  • Cường độ dòng điện: Độ phân ly của gel agarose giảm khi cường độ dòng điện tăng cao. Cường độ điện trường không được lớn hơn 5V/cm (tính từ khoảng cách 2 điện cực)
  • Thành phần base và nhiệt độ: trong trường hợp nồng độ agarose thấp hơn 0.5% thì phải điện di ở 40C nếu không thành phần các base sẽ ảnh hưởng đến sự chuyển động của các DNA
  • Ethidium bromide: ethidium bromide ảnh hưởng đến 15% tốc độ di chuyển của các của các đoạn DNA thẳng
  • Dung dịch đệm điện di: dung dịch đệm ảnh hưởng đến DNA trong gel. Trường hợp nồng độ dung dịch đệm quá cao gel sẽ bị chảy và DNA bị biến tính.

Các bước thực hiện

Bước 1: Đổ gel:

Dùng băng keo dán chặt hai đầu của khay điện di, đặt lược sẳn ở 1 đầu khay. Đặt khay ở nơi bằng phẳng, dùng miếng bọt khí để kiểm tra.

Cân 0.4g agarose cho vào bình tam giác 250ml, thêm 50 ml nước cất. Lắc nhẹ cho agarose hòa lẫn trong nước.

Đặt bình tam giác vào lò vi song đun khoảng 3-5 phút. Dung dich trong bình tam giác trở thành màu trắng trong.

Lấy bình tam giác ra, đợi 15 phút rờ thấy vừa nóng (60oC) thì đổ nhẹ dung dịch vào khay điện di. Khoảng 45 phút thì agarose đặc lại, gel đổi thành màu trắng đục.

Bước 2: Chạy gel.

Đặt khay vào bể điện di, lấy nhẹ lược ra, không làm động đến gel.

Thêm dung dich đệm điện di phủ mặt gel khoảng 1mm.

Dùng pipette P100 hút 10ul loading buffer chia thành 4 giọt trên paraffin

Dùng pipette P100 hút 10ul mẫu, trộn với 1 giọt loading buffer sau đó load vào giếng. Giếng đầu tiên có thể chạy DNA chuẩn.

Khởi động nguồn điện, chọn voltage thích hợp. Nhấn nút Run.

DNA sẽ chạy từ cực âm sang cực dương. Do DNA mang điện tích âm (các gốc phosphate mang điện tích âm đưa ra ngoài)

Sau khi DNA chạy được hơn 2/3 mẫu gel thì nhấn nút stop. Lấy khay điện di ra.

Nhuộm gel với Ethidium Bromide.

Xem gel dưới đèn UV.

In kết quả.

1.2.3/Chuẩn bị các dung dịch , môi trường và dụng cụ

1.2.3.1/Các bước chuẩn bị dung dịch,môi trường

  • Chuẩn bị dung dịch stock.
  • Pha chế môi trường.
  • Khử trùng
    • Khử trùng nhiệt khô.
    • Khử trùng nhiệt ướt.
    • Khử trùng môi trường.
    • Khử trùng vật dụng.

Chú ý khi khử trùng

  • Ø Không bao giờ khử trùng micropipette.
  • Không bao giờ khử trùng giấy thấm bằng nhiệt khô.
  • Những chất kháng sinh không được khử trùng bằng autoclave.
  • Những vật dụng bằng thủy tinh, nhựa phải được rửa sạch.

Vật thủy tinh, nhựa

Vật dụng thủy tinh, nhựa rất thường được sử dụng trong phòng thì nghiệm sinh học phân tử. Các vật dụng này trước khi sử dụng phải được rửa cẩn thận. Những vật dụng không được rửa sạch, còn dính vi khuẩn có thể ức chế các phản ứng hoặc phân giải của DNA

Vật dụng thủy tinh phải được rửa sạch bằng xà phòng, tráng lại bằng nước cất và được khử trùng bằng nồi khử trùng nhiệt ướt hoặc nhiệt khô.

Đối với những thí nghiệm với RNA, vật dụng thủy tinh và các dung dịch phải được xử lý với diethylpyrocarbonate để ức chế  RNase enzymes.

Đa số các vật dụng bằng nhựa như ống hút (pipette), Ống nuôi cấy (falcon), đĩa petri được cung cấp dưới dạng đã khử trùng rồi.

Các vật dụng khác như đầu cone, ống tube dùng cho máy ly tâm phải được khử trùng trước khi sử dụng.

1.2.4/Các hóa chất trong quá trình chiết xuất DNA

1.2.4.1/Ethidium Bromide (EtBr)

Ethidium Bromide là chất có khả năng gây đột biến, nếu chạm phải hoặc tẩy rửa không đúng cách sẽ có nguy cơ bị nhiễm Ethidium Bromide.

 

Ethidium Bromide & the process of interlacation, illustrating the lengthening and untwisting of the DNA helix (http://www.madsci.org)

 

Ethidium Bromide (http://en.wikipedia.org/wiki/Ethidium_bromide)

Đây là chất dùng trong phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, chủ yếu dùng để nhuộm, (đánh dấu) DNA/RNA khi chạy điện di. Hiện nay có các cách dùng như sau:

Bổ sung trực tiếp Ethidium Bromide vào dung dịch đệm chạy điện di (buffer chạy gel). Với cách này, lượng Ethidium Bromide cần phải thu hồi khi loại thải buffer chạy gel là rất lớn. Đây là cách ít được dùng nhất.

Ethidium Bromide được bổ sung vào dung dịch đệm load mẫu, vì chỉ có một lượng rất nhỏ dung dịch load mẫu được sử dụng mỗi khi chạy điện di nên lượng Ethidium Bromide sử dụng cũng sẽ rất ít. Nhưng sự bất lợi ở đây là lượng Ethidium Bromide cần lấy mỗi lần load mẫu là quá it, khó có thể lấy chính xác bằng micropipette.

Ethidium Bromide được bổ sung vào gel, lúc gel còn chưa đặc sau đó lắc trộn đều, với cách này DNA (load mẫu) vẫn được nhuộm tốt. Trong quá trình chạy điện di, khoảng 10% Ethidium Bromide trong gel sẽ khuếch tán ra ngoài buffer chạy gel. Trong trường hợp này, phần lớn Ethidium Bromide sẽ được loại bỏ dưới dạng rắn (dính trong gel). Nồng độ thích hợp thường là 5µg/ml gel solution.

Một vài quy trình chạy điện di thì thực hiện nhuộm DNA sau khi chạy điện di. Bằng cách này buffer chạy gel không bị nhiễm Ethidium Bromide và có thể loại bỏ trực tiếp không qua xử lý. Gel sau khi chạy điện di xong sẽ được ủ trong dung dich pha sẳn có chứa Ethidium Bromide và có thể tái sử dụng dung dịch này, tuy nhiên sau mỗi lần sử dụng phải bổ sung thêm cho đúng thể tích. Phương pháp này có thể không được ưa thích lắm đối với một số nhà nghiên cứu.

Các yêu cầu đối với chất thải Ethidium Bromide:

  • Gel chạy điện di chứa Ethidium Bromide:

Tất cả những gel, chất rắn chứa Ethidium Bromide cần phải được thu nhặt và loại bỏ khỏi môi trường làm việc như là các chất thải độc hại.

Phải đóng gói riêng biệt

  • Dung dịch chứa Ethidium Bromide:

Những dung dịch đệm có nồng độ cao hơn 10µg/ml cần phải được lọc, khử, thiêu hủy Ethidium Bromide hoặc lưu trữ lại như là các chất thải hóa học nguy hiểm.

Khi dung dịch có nồng độ thấp hơn 10µg/ml có thể được loại thải qua cống rãnh.

  • Dụng cụ thao tác đối với các đối tượng có chứa Ethidium Bromide:

Những dụng cụ thí nghiệm liên quan đến Ethidium Bromide cần để ở những nơi riêng biệt và làm dấu rõ ràng.

Các phương pháp xử lý EtBr hiện nay trên thế giới đang sử dụng:

  • · Dùng kit lọc có bán sẵn để loại bỏ EtBr trong nước thải.

 

Tác nhân lọc chủ yếu là than hoạt tính, nước thải sau khi  lọc có thể đổ ra cống rãnh.

Những bộ kit lọc bán sẵn được cung cấp từ BIO 101, trong đó chủ  yếu là than hoạt tính đựng dưới dạng túi trà, mỗi túi có thể hấp thụ 10mg EtBr, một bộ kit 50 túi nên có thể hấp thụ 500mg EtBr khỏi dung dịch. Túi than sau khi xử lý cần loại bỏ như là chất thải hóa học độc hại.

  • · Loại bỏ dung dịch có nồng độ thấp (chưa đến 100mg/ml).

Cách 1 (Lunn và Sanrone 1987):

+ Thêm 2,9g Amberlite – XAD – 16 cho mỗi 100ml dung dịch xử lý.

+ Trữ dung dịch trong 12h ở nhiệt độ phòng thỉnh thoảng lắc đều.

+ Lọc dung dịch qua giấy lọc Whatman No.1. Đổ bỏ dịch lọc xuống cống.

+ Bỏ giấy lọc và Amberlite vào túi nhựa, buộc kín, loại bỏ.

Cách 2 (Bensaude 1988).

+ Thêm 300mg bột than hoạt tính cho mỗi 100ml dung dịch cần xử lý.

+ Để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc đều.

+ Lọc hỗp hợp qua giấy lọc Whatman No.1. Đổ bỏ dịch lọc xuống cống.

+ Bỏ giấy lọc và Amberlite vào túi nhựa, buộc kín, loại bỏ.

  • · Xử lý đối với những dung dịch có nồng độ đậm đặc (>= 0,5mg/ml) (Lunn và Sansone 1987).

-                 Bước 1: Thêm đủ nước để hạ nồng độ EtBr xuống đến 0,5mg/ml, hoặc thấp hơn (thực hiện trong tủ hút).

-                 Bước 2: Bổ sung 20ml hypophosphorous acid 5% và 12ml 0,5mol Sodium nitrite, trộn cẩn thận. ( Hypophosphorous thường được lấy ra ở nồng độ 50% sau đó pha loãng 10 lần để được 5% ngay trước khi sử dụng).

-                 Bước 3: Chuẩn bị sodium nitrite: Cân 3,45g sodium nitrite, sau đó hòa tan vào nước, đưa về thể tích 100ml (thực hiện trong tủ hút).

-                 Bước 4: Sau khi ủ 24h ở nhiệt độ phòng, đưa pH về trong khoảng 5-9 bằng sodium bicarbonat. Sau đó đổ bỏ dịch xuống cống.

* Không sử dụng hypochloride để xử lí EtBr. Vì xử lí với thuốc tẩy có thể tạo sản phẩm gây đột biến mạnh hơn và lượng EtBr còn thừa lại sau khi xử lý là 20%.

Khử nhiễm bề mặt do EtBr.

- Lau chất lỏng rơi ra bằng giấy thấm. Bỏ rác vào túi nilon, làm dấu buộc kín và để nơi an toàn. Những vật dụng có nhiễm EtBr cần để riêng biệt và đánh dấu để phân biệt.

 

1.2.4.2/Cetyl Trimethylammonium Bromide (CTAB)

 CTAB có khả năng liên kết thuận nghịch với ADN và polysaccharide, cụ thể ở nồng độ muối cao (trên 1.4 M NaCl có trong đệm chiết) thì CTAB kết hợp với ADN và polysaccharide nhưng phức hợp CTAB-ADN tồn tại ở trạng thái hòa tan, trong khi đó phức CTAB-polysaccharide lại kết tủa, phức này sẽ được loại đi ở bước ly tâm đầu tiên. Ở nồng độ muối dưới 0.7M thì phức CTAB-ADN lại kết tủa, cho phép thu hồi lại ADN ở bước tủa cồn. Ở nồng độ muối thấp phức CTAB-ADN sẽ tách nhau ra. Phức này sẽ tách ra gần như hoàn toàn trong bước rửa bằng cồn 700

CTAB buffer:

0.2M Tris-Cl pH7.5

2M NaCl

0.05M EDTA

2% (w/v) CTAB

1.2.4.3/TE buffer

Là một loại buffer thường sử dụng trong Sinh Học Phân Tử, TE buffer giúp bất hoạt enzyme nuclease góp phần bảo vệ DNA trong mẫu. Thành phần bao gồm:

10 mM Tris-Cl, pH 8

1 mM EDTA

Những nghiên cứu về enzyme nuclease từ những năm 1980 đã chỉ ra rằng enzyme này ít hoạt động nhất ở vùng pH 7,5 đối với RNA và pH 8 đối với DNA.

EDTA làm bất hoạt enzyme nuclease bằng cách lấy đi những ion kim loại cần thiết cho enzyme này.

1.2.4.4/Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)

 

 

Có tác dụng giúp phá vỡ màng tế bào, giúp cho quá trình ly trích DNA được thuận lợi hơn.

1.2.4.5/Extraction Buffer (EB)

Thành phần bao gồm:

0.1M Tris-Cl

0.5M NaCl

0.05M EDTA

0.01M betamercaptho ethanol

Có tác dụng làm biến tính protein (cắt các cầu nối disulfite), đồng thời bảo vệ DNA trong mẫu không bị biến tính.

1.2.4.6/Proteinase K (endopeptidase K)

Trong quá trình ly trích DNA sẽ có sự hiện diện của rất nhiều protein, làm cho mẫu DNA không sạch, các protein đó cần phài được loại bỏ proteinase K được sử dụng để loại bỏ các protein này, góp phần làm sạch mẫu DNA. Ngoài ra proteinase K còn góp phần phân giải enzyme nuclease giúp cho DNA ít bị biến tính hơn. Proteinase K thường được duy trì trong sự hiện diện của SDS, EDTA và urea.

Tế bào vi khuẩn được hòa tan trong SDS và Proteinase K.

1.2.4.7/Isopropanol

Dùng để tủa DNA với tỷ lệ 1:1 với dung dịch cần tủa

 

1.2.4.8/Hỗn hợp Chloroform:Isoamylalcohol (24:1)

Dùng để loại bỏ protein, những polycaccharide và phức hợp. Sau khi li tâm với vận tốc 13000rpm trong 5 phút dung dịch  chia ra thành 3 lớp: lớp thứ nhất là phần dịch trong ở trên cùng có chứa DNA, lớp thứ  hai là một lớp protein, lớp kế tiếp có chứa chloroform và tất cả những thành phần cần loại bỏ khác (polysaccharides, protein,…).

1.2.4.9/Ethanol 96% và 70%

Ethanol 96% dùng để tủa DNA và bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme. Chúng kết hợp với muối để tránh gây hại cho DNA.

Ethanol 70% dùng để rửa tủa, loại muối ra khỏi DNA

 

2.PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1/Trích DNA từ vi khuẩn gam âm

2.1.1/Phương tiện

  • Micropipette
  • Ống tube 1.5 và 2.2 ml
  • Máy lắc ủ
  • TE pH8
  • Proteinase K
  • Isopropanol
  • Cloroform/Isoamylalchohol (24:1)
  • SDS
  • 10% CTAB/0.7M NaCl

2.1.2/Phương pháp

Chuẩn bị mẫu:

Nuôi vi khuẩn E.Coli trong 6ml môi trường LB (Luria Broth) nuôi qua đêm, ủ ở 370C

Trích DNA:

Bước 1: Ly tâm thu sinh khối vi khuẩn: Cho vào 3 túp (2,2ml) mỗi túp 2ml dung dịch vi khuẩn E.coli đã được nuôi cấy qua đêm. Sau đó, li tâm ở 13000rpm trong 10 phút. Li tâm xong loại bỏ phần trong lấy phần tủa phía dưới.

Bước 2: hòa tan DNA: Bơm 250ml TE pH 8 vào túp thứ nhất để hòa tan kết tủa ở túp thứ nhất, sau đó chuyển phần dung dịch ở túp thứ nhất sang túp thứ hai, túp thứ hai sang túp thứ ba, hòa tan DNA ở túp thứ ba.

Bước 3: chiết xuất DNA: Sau đó, cho thêm vào túp 50ml dung dịch 10% SDS cộng 5ml proteinase K lắc đều, ủ 20 phút ở nhiệt độ 65oC, mỗi 5 phút đảo ngược túp một lần để trộn đều dung dịch, có tác dụng phá vỡ màng tế bào và màng nhân, chiết xuất và tinh sạch DNA.

Bước 4: tạo phức với CTAB: Sau khi hòa tan hết tủa ta cho thêm vào túp 400ml CTAB và ủ ở 65oC trong 20 phút, khoảng 5 phút đảo ngược ống túp để trộn đều.

Bước 5: loại bỏ protein và các phức hợp: Tiếp tục thêm 600ml chloroform:isoamylalcohol (24/1), lắc đều và li tâm ở 13000 vòng trong 10 phút để loại bỏ protein, những polysaccharide và các phức hợp trên.

Bước 6: tủa DNA: Li tâm xong, chuyển 500ml  phần trong ở phía trên vào túp mới và thêm 1ml isopropanol lắc đều, giữ ở – 20oC trong 30 phút nhằm mục đích tủa DNA, không cho DNA biến tính, thu được DNA nhiều hơn và bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme. Tiến hành li tâm ở 13000 vòng trong 10 phút để tập trung lượng DNA kết tủa xuống đáy túp.

Bước 7: loại bỏ phần dịch trong: Sau khi li tâm, ta loại bỏ phần dịch trong ở phía trên và thu phần kết tủa ở phía dưới.

Bước 8: rửa tủa: Rửa tủa với 1ml ethanol 70% ly tâm ở 13000rpm trong 5 phút, làm 2 lần để loại bỏ muối bám trong DNA và loại bỏ lượng isopropanol còn lại trong DNA (mỗi lần đổ bỏ ethanol).

Bước 9: phơi khô DNA: Rửa DNA xong, ta tiến hành phơi DNA qua đêm ở nhiệt độ phòng cho sạch hết ethanol tránh ảnh hưởng đến DNA tổng số.

Sau đó, hòa tan DNA bằng 30ml nước cất, lắc đều cho DNA tan ra và tiến hành đo OD

2.2/Trích DNA từ tôm

2.2.1/Phương tiện

  • Cơ tôm hay biểu bì dưới da đầu tôm
  • Dung dịch trích Lysis buffer
  • TE buffer 0.1X
  • Máy ly tâm
  • Micropipette
  • Ống tube 1.5 và 2.2 ml
  • Kéo, kẹp, đủa thủy tinh

2.2.2/Phương pháp

Chuẩn bị mẫu:

Tôm đem bốc bỏ vỏ ở phần lưng tôm, dùng kéo cắt khoảng 100mg thịt tôm cho vào túp 2,2ml. Sau đó, dùng đũa thủy tinh nghiền mẫu thành bột mịn.

Trích DNA:

 Bước 1: phá vở màng tế bào: Mẫu sau khi nghiền mịn cho thêm vào túp 400ml dung dịch trích buffer D giúp phá vở màng tế bào, lắc đều và ủ qua đêm ở nhiệt độ 50oC

Bước 2: tách protein và các thành phần hữu cơ ra khỏi DNA:  Sau khi ủ xong, ta cho thêm vào túp 400ml dung dịch chloroform:isoamylalcohol (24:1) để tách protein và các thành phần hữu cơ khác (polysaccharides, polyphenols, lipids,…), lắc nhẹ rồi đem ly tâm với vận tốc 13000 vòng/phút trong thời gian 10 phút.

Bước 3: tủa DNA: Ta tiến hành hút 300ml phần dịch trong ở phía trên cho qua một túp 2,2ml mới, sau đó thêm vào túp này 150ml 7,5M ammonium acetate và 600ml ethanol 96% có tác dụng giúp DNA kết tủa. Lắc nhẹ và tiến hành li tâm với vận tốc 13000 vòng/phút trong 5 phút.

Bước 4: rửa DNA: Sau khi li tâm xong, ta loại bỏ phần dịch trong ở trên lấy phần cặn ở phía dưới. Rửa phần cặn với 600ml ethanol 70% 2 lần để loại bỏ muối ra khỏi DNA. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút sau mỗi lần rửa. Đổ bỏ ethanol sau mỗi lần rửa.

Bước 5: sấy khô DNA: Sấy khô bằng máy ly tâm chân không ở nhiệt độ 45oC trong 15 phút, tránh trường hợp mẫu DNA còn chứa ethanol sẽ ảnh hưởng đến DNA tổng số.

Bước 6: hòa tan DNA: Sau khi sấy mẫu xong, hút 30ml nước cất cho vào túp chứa DNA để hòa tan DNA.

Sau đó hút 10ml dung dịch này cho vào túp 1,5ml mới đã hút sẳn 90ml nước cất, lắc đều. Sau đó đem mẫu đo OD.

2.3/Trích DNA từ thực vật

2.3.1/Phương tiện

  • Lá bưởi Diễn
  • Bộ điện di minisub gel.
  • Kéo cắt mẫu, chày và cối nghiền mẫu
  • Micropipette
  • Ống tube 1.5 và 2.2 ml
  • Extraction buffer (EB)
  • CTAB buffer
  • Agarose
  • Isopropanol
  • Cloroform/Isoamylalchohol (24:1)
  • SDS
  • Nitơ lỏng

2.3.2/Phương pháp

Chuẩn bị mẫu:

Mẫu lá bưởi được khử trùng bằng cồn 70o (dùng bông gòn thấm cồn và lau đều trên cả hai bề mặt lá), dùng kéo cắt lấy phần thịt lá ở hai bên và bỏ phần gân lá ở giữa. Phần thịt lá được gói trong giấy nhôm và ngâm nitơ lỏng trong thời gian 15 phút. Sau đó, nghiền kỉ mẫu bằng cối và chày đã được khử trùng bằng cách ngâm nitơ lỏng. Trong quá trình nghiền ta thêm nitơ lỏng vào nhằm mục đích ức chế các enzym gây biến tính DNA của lá, mẫu được nghiền cho đến khi thành bột mịn.

Trích DNA:

Bước 1: phá vở màng tế bào và màng nhân: Chuyển phần bột mịn vào túp 2,2ml. Tiếp tục cho 50ml dung dịch SDS 10% vào túp có tác dụng giúp DNA dễ hòa tan hơn, sau đó lắc nhẹ túp (tránh DNA bị gãy).

Bước 2: ủ mẫu: Mẫu sau khi thêm các dung dịch đem ủ ở nhiệt độ 65oC trong 30 phút, trong quá trình ủ khoảng 5 phút đảo nhẹ túp để trộn mẫu.

Bước 3: li tâm: Sau thời gian ủ, mẫu được đem li tâm với vận tốc 13000rpm trong 10 phút, để tách các thành phần khác nhau của tế bào.

Bước 4: tủa DNA: Li tâm xong ta hút 800ml phần dung dịch trong ở phía trên cho vào túp mới, sau đó cho 800ml dung dịch isopropanol vào túp và tiến hành ủ trong thời gian khoảng 30 phút ở -20oC để kết tủa DNA, không cho DNA biến tính, giúp tăng khả năng thu DNA. Ở điều kiện này nhiều protein và các chất khác cũng bị kết tủa cùng ADN nên trong mẫu sẽ bị lẫn tạp. Sau đó, tiến hành li tâm với vận tốc 13000rpm trong 10 phút.

Bước 5: hòa tan tủa: Li tâm xong, phần dịch trong  được bỏ vào một cái hộp mũ có chứa  nước và thu phần kết tủa. Hòa tan tủa DNA trong 400ml TE, TE giữ DNA ổn định, không bị biến tính.            

Bước 6: tạo phức với CTAB: Sau khi tủa hòa tan hết ta cho thêm vào túp 400ml CTAB và ủ ở 65oC trong 15 phút, khoảng 5 phút đảo ngược ống túp để trộn đều

Bước 7: loại bỏ protein và các phức hợp: Sau đó cho thêm vào túp 800ml Chloroform/Isoamylalcohol lắc đều và li tâm với vận tốc 13000rpm trong 5 phút để loại bỏ protein, những polycaccharide và phức hợp trên

Bước 8: tủa DNA: Sau khi ly tâm ta tiến hành hút 650ml phần dịch trong ở phía trên cho qua một túp 2,2ml mới, thêm vào túp này 1.4ml Ethanol 96% ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 15 phút để tủa DNA và bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme. Sau đó, li tâm ở 13000rpm trong 10 phút.

Bước 9: rửa DNA: Li tâm xong đổ bỏ phần dịch trong ở phía trên vào hộp mũ có chứa nước, thu lấy phần kết tủa ở phía dưới. Sau đó, tiến hành rửa kết tủa với ethanol 70% để loại bỏ muối ra khỏi DNA. Phần kết tủa được rửa 2 lần với ethanol 70% (không gây hại cho DNA do ở nồng độ thấp). Mỗi lần rửa cho 400ml ethanol 70% vào túp, lắc nhẹ và đem li tâm trong 5 phút với vận tốc 13000rpm, sau đó loại bỏ ethanol.

Bước 10: sấy khô DNA: Sấy khô bằng máy ly tâm chân không ở nhiệt độ 45oC trong 15 phút, tránh trường hợp mẫu DNA còn chứa ethanol sẽ ảnh hưởng đến DNA tổng số.

Bước 11: hòa tan DNA: DNA sau khi sấy khô được hòa tan với 100ml TE 0.1. Dung dịch DNA được dùng để chạy điện di.

3.KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG MẪU

3.1/Đo OD đối với mẫu vi khuẩn và tôm

Lấy 100ml nước khử ion vô trùng vào cuvet 100ml, đo đối chứng.
           Hoà 10ml dịch ADN cần đo vào 90ml nớc khử ion vô trùng, bơm vào cuvet, đo ở bước sóng 260nm, 280nm
           Đọc độ hấp thụ trên máy đo quang phổ ở bước sóng 260 nm, 280 nm. Xử lý số liệu

3.2Điện di đối với mẫu lá

Khay điện di được đặt lược sẳn ở một đầu khay. Sử dụng lược có số răng là 17. Khay được đặt ở nơi bằng phẳng.

Gel sử dụng chạy điện di lá:  40ml với nồng độ 1% agrarose.

Trước tiên cân 0,4g agrarose cho vào chai thủy tinh, sau đó cho vào chai 50ml Bufer TE, trừ hao trong quá trình nấu bốc hơi hết 10ml. Lắc chai cho agrarose hòa tan vào Buffer TE, sau đó đem nấu trong microwave trong 2 phút ở 450W (nấu cho agrarose hòa tan hoàn toàn và trong như nuớc), agrarose sau khi nấu xong để nguội khoảng 60oC rồi đổ nhẹ dung dịch vào một đầu khay dung dịch sẽ tự trải đều khay. Khoảng 45 phút sau gel đặc lại, ta dùng tay lấy lược ra nhưng phải cẩn thận tránh bị bể gel.

Đặt khay vào bể điện di, thêm dung dịch điện di phủ mặt gel khoảng 2mm.

Sau khi gel chuẩn bị xong, ta tiến hành load mẫu vào các giếng của gel

+ Load mẫu:

Đầu tiên hút dung dịch loading buffer (một dung dịch tải DNA chứa 30% glycerol, 0,25% bromophenol blue (BPB) và 0,25% xylencyanol (XC), trong thành phần có chứa glycerol có tỷ trọng cao sẽ kéo DNA nằm trong giếng không bị trôi ra ngoài trong khi load mẫu) và nhỏ thành từng giọt nhỏ khoảng 2ml ra giấy paraflim, sau đó hút 10ml dung dịch mẫu trộn điều với dung dịch loading buffer và tiến hành load mẫu vào giếng của gel. Bắt đầu load từ giếng thứ 2, giếng thứ nhất dùng để load thang chuẩn.

Sau khi load xong ta đậy nấp bể điện di lại và tiến hành chạy điện di. Thời gian điện di thay đổi phụ thuộc vào độ lớn của DNA, nồng độ agarose của gel và cường độ dòng điện. Sau khi chạy điện di xong bản gel được lấy nhẹ ra khỏi khuôn gel và ngâm vào dung dịch EtBr trong thời gian 30 phút có tác dụng đánh dấu phân tử DNA, hóa chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của nucleic acid và sẽ phát huỳnh quang dưới tác dụng của tia tử ngoại. Sau đó rửa sạch bản gel bằng nước cất.

 Quan sát và chụp hình: Bản gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại                      λ = 260-360 nm  trên bộ đọc gel bio-rad. Quan sát thấy ADN hiện lên dưới dạng các vạch sáng.

 4.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1/Kết quả

Kết quả đo OD các mẫu DNA.

OD
Mẫu

 

 

OD260 OD260/OD280 Nồng độ DNA (ng/µl)
Tôm 2.5825 1.9888 1291.25
E.Coli 1.4437 2.0032 721.85

 

 

Kết quả chụp gel điện di mẫu lá

                                        Vạch số 5 là vạch được đề cập trong báo cáo này

4.2/Thảo luận

4.2.1/Mẫu tôm

Kết quả OD260/OD280 là 1.9888 cho thấy DNA của mẫu tôm là khá tinh sạch,không bị nhiễm Protein cũng như Chlorofrom,đồng thời nồng độ DNA thu được cũng khá cao (1291.25 ng/µl)

4.2.2/Mẫu vi khuẩn

Kết quả đo OD260/OD280 (2.0032) cho ta biết độ tinh sạch của mẫu là khá tốt, tuy nhiên mẫu có thể bị nhiễm một ít Chloroform do sai sót trong quá trình thực hiện, có thể là sai sót trong quá trình rút mẫu sau khi ly tâm với cloroform/isoamylalchohol. đồng thời nồng độ DNA thu được cũng khá cao (721.85 ng/µl)

4.2.3/Mẫu lá bưởi

Mẫu ở giếng số 5, cho ta thấy DNA ít bị nhiễm muối(ít sáng ở vị trí giếng) và không có trường hợp bị gãy(chỉ có vạch sáng lớn, không có các vạch sáng ở dưới vạch sáng lớn) , tuy nhiên vạch sáng hơi mờ chứng tỏ nồng độ DNA thu được là không cao.

 

TRẢ LỜI CÂU HỎI

 

Câu 1: Công dụng của các chất:

Sodium Dodecyl Sulfate (SDS): Có tác dụng phá vỡ màng tế bào, DNA thoát ra môi trường ngoài.

Cetyl Trimethylammonium Bromide (CTAB): CTAB có khả năng liên kết thuận nghịch với ADN và polysaccharide, cụ thể ở nồng độ muối cao (trên 1.4 M NaCl có trong đệm chiết) thì CTAB kết hợp với ADN và polysaccharide nhưng phức hợp CTAB-ADN tồn tại ở trạng thái hòa tan, trong khi đó phức CTAB-polysaccharide lại kết tủa, phức này sẽ được loại đi ở bước ly tâm đầu tiên. Ở nồng độ muối dưới 0.7M thì phức CTAB-ADN lại kết tủa, cho phép thu hồi lại ADN ở bước tủa cồn. Ở nồng độ muối thấp phức CTAB-ADN sẽ tách nhau ra. Phức này sẽ tách ra gần như hoàn toàn trong bước rửa bằng cồn 700.

Proteinase K (endopeptidase K): Trong quá trình ly trích DNA sẽ có sự hiện diện của rất nhiều protein, làm cho mẫu DNA không sạch, các protein đó cần phài được loại bỏ proteinase K được sử dụng để loại bỏ các protein này, góp phần làm sạch mẫu DNA. Ngoài ra proteinase K còn góp phần phân giải enzyme nuclease giúp cho DNA ít bị biến tính hơn. Proteinase K thường được duy trì trong sự hiện diện của SDS, EDTA và urea.

Isopropanol: Dùng để tủa DNA (thể tích isopropanaol tỷ lệ 1:1 với dung dịch cần tủa)

Hỗn hợp Chloroform:Isoamylalcohol (24:1): Dùng để loại bỏ protein, polycaccharide và các phức hợp không phải DNA. Sau khi li tâm với vận tốc 13000rpm trong 5 phút dung dịch  chia ra thành 3 lớp: lớp thứ nhất là phần dịch trong ở trên cùng có chứa DNA, lớp thứ  hai là một lớp protein, lớp kế tiếp có chứa chloroform và tất cả những thành phần cần loại bỏ khác.

Ethanol 96% và 70%: Ethanol 96% dùng để tủa DNA và bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme. Chúng kết hợp với muối để tránh gây hại cho DNA.

Ethanol 70% dùng để rửa tủa, loại bỏ isopropanol, muối CTAB ra khỏi DNA

Câu 2: Sự khác nhau khi dùng TE 0.1X và nước để hòa tan DNA

          TE 0.1 Buffer bao gồm 10mM Tris pH8 ,0.1 mM EDTA (pH 8) có tác dụng bảo quản DNA (chống oxy hóa DNA, bảo vệ DNA khỏi sự phân hủy của các enzyme) trong thời gian lâu hơn so với khi ta hòa tan DNA với nước.

Câu 3: DNA cần phải được làm khô trước khi hòa tan

          DNA sau khi rửa được làm khô bằng cách phơi ở nhiệt độ phòng qua đêm hay sấy khô. Mục đích tránh mẫu DNA còn chứa ethanol sẽ ảnh hưởng đến DNA tổng số. Và quá trình phân tích mẫu về sau. Khi cần có thể hòa tan lại với nước theo nồng độ mong muốn.

Câu 4:

          Nồng độ và số lượng DNA ở mẫu tôm:

Ta có: OD260nm  = 1 Þ DNA = 50ng/ml

Qua kết quả đo OD của Tôm ta có: OD260nm = 2.5825

Trước khi tiến hành đo OD, mẫu đã được pha loãng 10 lần. Vậy nồng độ DNA trong mẫu Tôm thu được:

CDNA= OD260nm * 50ng/ml*10 = 2.5825*50ng/ml*10 = 1291.25 ng/ml.

Dung dịch DNA trước khi pha loãng là 30 ml nên số lượng DNA thu được là: 30*1291.25 = 38,737.5ng

Kết quả OD260/OD280 là 1.9888 cho thấy DNA của mẫu tôm là khá tinh sạch,không bị nhiễm Protein cũng như Chlorofrom,đồng thời nồng độ DNA thu được cũng khá cao (1291.25 ng/µl)

Tương tự:

Nồng độ và số lượng DNA ở mẫu vi khuẩn:

CDNA= OD260nm * 50ng/ml*10 = 1.4437*50ng/ml*10 = 721.85ng/ml.

Dung dịch DNA trước khi pha loãng là 30 ml nên số lượng DNA thu được là: 30*721.85= 21,655.5 ng

Kết quả đo OD260/OD280 (2.0032) cho ta biết độ tinh sạch của mẫu là khá tốt, tuy nhiên mẫu có thể bị nhiễm một ít Chloroform do sai sót trong quá trình thực hiện, có thể là sai sót trong quá trình rút mẫu sau khi ly tâm với cloroform/isoamylalchohol. đồng thời nồng độ DNA thu được cũng khá cao (721.85 ng/µl)

Câu 5:Chất lượng và số lượng DNA lá  dựa trên kết quả điện di

Mẫu ở giếng số 5, cho ta thấy DNA ít bị nhiễm muối và không có trường hợp bị gãy, tuy nhiên vạch thể hiện hơi mờ chứng tỏ nồng độ DNA thu được là không cao.

Bài tập

a.Lượng hóa chất để hòa tan các dung dịch Stock có nồng độ sau:

Đồng nhất thể tích dung dịch pha V= 1lit

* Tris 1M (M= 121.13g/mol)

CM Tris = n/V=m/(M*V) => m= CM Tris * (M*V) = 1x (121.13 *1) =121.13g

*EDTA 0.5M (M=372.24 g/mol)

CM EDTA = n/V=m/(M*V) => m= CM EDTA* (M*V) = 0.5 x (372.24 *1) =186.12g

*NaCl 5M( M=58.4 g/mol)

CM NaCl = n/V=m/(M*V) => m= CM NaCl * (M*V) = 5 x (58.4*1) = 292 g

b.Pha V2 ml Buffer A (0.1M Tris; 0.5M NaCl, 0.005M EDTA pH 8) từ các dung dịch gốc Tris 1M, NaCl 5M, EDTA 0.5M. Phải mất bao nhiêu dung dịch gốc để pha Buffer A.

      Dựa vào công thức C1V1=C2V2 ta tính được các thể tích các dung dịch gốc cần pha như sau: V1 = C2V2 / C1

* VTris.HCl = 0.1* V2/1 = V2/10  ml

* VNaCl = 0.5* V2/5 = V2 /10 ml

* VEDTA = 0.005* V2/0.5 = V2 /100 ml

Tổng thể tích của dung dịch gốc = V2/10 + V2/10  +V2/100  =21V2/100 ml

Þ Thể tích nước cất thêm vào = V2– 79 V2/100=  79V2/100 ml

 

 

About these ads

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s