CHIẾT XUẤT DNA


XỬ LÝ ETHIDIUM BROMIDE(EtBr)

1. Sơ lược về EtBr:

EtBr là chất có khả năng gây đột biến, nếu chạm phải hoặc tẩy rửa không đúng cách sẽ có nguy cơ bị nhiễm EtBr.

Đây là chất dùng trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử, chủ yếu dùng để nhuộm (đánh dấu) DNA/RNA khi chạy điện di. Hiện nay có các cách dùng như sau:

+ Bổ sung trực tiếp EtBr vào dung dịch đệm chạy điện di.

+ EtBr được bổ sung vào dung dịch đệm load mẫu.

+ EtBr được bổ sung vào gel, lúc còn chưa đặc lại, sau đó lắc trộn đều, với cách này DNA (load mẫu) vẫn được nhuộm tốt.

+ Một vài qui trình chạy điện di thì thực hiện nhuộm DNA sau khi chạy điện di.

2.  Các phương pháp loại bỏ EtBr:

Các  yêu cầu đối với chất thải EtBr:

2.1. Gel chạy điện di chứa EtBr:

Tất cả những gel, chất rắn có chứa EtBr cần phải được thu nhặt và loại bỏ khỏi môi trường làm việc như các chất thải độc hại.

Phải đóng gói riêng biệt, ghi chú rõ là rác thải có chứa EtBr.

2.2. Ethidium bromide solution:

Những dịch đệm chứa nhiều hơn 0,5mg/ml EtBr cần phải được lọc, khử hoặc thiêu hủy EtBr hoặc lưu trữ lại như là những chất thải hóa học nguy hiểm.

Khi dung dịch ít hơn 0,5mg/ml có thể được thải bỏ qua cống rãnh.

2.3. Dụng cụ thao tác đối với các đối tuợng có chứa EtBr:

Những dụng cụ thí nghiệm liên quan đến EtBr cần để ở những nơi riêng biệt và làm dấu rõ ràng.

3. Các phương pháp xử lý EtBr hiện nay trên thế giới đang sử dụng:

3.1.Dùng kit lọc có bán sẵn để loại bỏ EtBr trong nước thải.

Tác nhân lọc chủ yếu là than hoạt tính, nước thải sau khi  lọc có thể đổ ra cống rãnh.

Những bộ kit lọc bán sẵn được cung cấp từ BIO 101, trong đó chủ  yếu là than hoạt tính đựng dưới dạng túi trà, mỗi túi có thể hấp thụ 10mg EtBr, một bộ kit 50 túi nên có thể hấp thụ 500mg EtBr khỏi dung dịch. Túi than sau khi xử lý cần loại bỏ như là chất thải hóa học độc hại.

3.2. Loại bỏ dung dịch có nồng độ thấp (chưa đến 100mg/ml).

3.2.1. Cách 1 (Lunn và Sanrone 1987):

+ Thêm 2,9g Amberlite – XAD – 16 cho mỗi 100ml dung dịch xử lý.

+ Trữ dung dịch trong 12h ở nhiệt độ phòng thỉnh thoảng lắc đều.

+ Lọc dung dịch qua giấy lọc Whatman No.1. Đổ bỏ dịch lọc xuống cống.

+ Bỏ giấy lọc và Amberlite vào túi nhựa, buộc kín, loại bỏ.

3.2.2. Cách 2 (Bensaude 1988).

+ Thêm 300mg bột than hoạt tính cho mỗi 100ml dung dịch cần xử lý.

+ Để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc đều.

+ Lọc hỗp hợp qua giấy lọc Whatman No.1. Đổ bỏ dịch lọc xuống cống.

+ Bỏ giấy lọc và Amberlite vào túi nhựa, buộc kín, loại bỏ.

3.3.Xử lý đối với những dung dịch có nồng độ đậm đặc (>= 0,5mg/ml) (Lunn và Sansone 1987).

-                      Bước 1: Thêm đủ nước để hạ nồng độ EtBr xuống đến 0,5mg/ml, hoặc thấp hơn (thực hiện trong tủ hút).

-                      Bước 2: Bổ sung 20ml hypophosphorous acid 5% và 12ml 0,5mol Sodium nitrite, trộn cẩn thận. ( Hypophosphorous thường được lấy ra ở nồng độ 50% sau đó pha loãng 10 lần để được 5% ngay trước khi sử dụng).

-                      Bước 3: Chuẩn bị sodium nitrite: Cân 3,45g sodium nitrite, sau đó hòa tan vào nước, đưa về thể tích 100ml (thực hiện trong tủ hút).

-                      Bước 4: Sau khi ủ 24h ở nhiệt độ phòng, đưa pH về trong khoảng 5-9 bằng sodium bicarbonat. Sau đó đổ bỏ dịch xuống cống.

* Không sử dụng hypochloride để xử lí EtBr. Vì xử lí với thuốc tẩy có thể tạo sản phẩm gây đột biến mạnh hơn và lượng EtBr còn thừa lại sau khi xử lý là 20%.

3.4. Khử nhiễm bề mặt do EtBr.

- Lau chất lỏng rơi ra bằng giấy thấm. Bỏ rác vào túi nilon, làm dấu buộc kín và để nơi an toàn. Những vật dụng có nhiễm EtBr cần để riêng biệt và đánh dấu để phân biệt.

CHIẾT SUẤT VÀ TINH SẠCH AND

I. GIỚI THIỆU:

Toàn bộ ADN của tế bào, bao gồm tất cả gen và những vùng liên gen được gọi là bộ gen. Bộ gen người chứa khoảng 80.000 gen, nhưng những vùng mã hóa của gen này chiếm khoảng 3% của toàn bộ gen. Bộ gen của nấm chứa khoảng 6.000 gen. Bộ gen của một vài thực vật có nhiều trình tự lặp lại. Bộ gen của prokaryote rất nhỏ được chứa trong nhiễm sắc thể có dạng vòng, prokaryote cũng có thể có những gen nằm trong plasmid. Bộ gen của prokaryote không có intron và những trình tự lặp lại.

Muốn nghiên cứu về bộ gen, kỹ thuật tinh chiết ADN là một trong những kỹ thuật sinh học phân tử đầu tiên vô cùng quan trọng góp phần cho sự thành công của những bước quan trọng tiếp theo.

Hiện nay có nhiều phương pháp từ phức tạp, đòi hỏi nhiều thiết bị đắt tiền, đến các phương pháp  đơn giản hơn, thời gian làm việc rút ngắn tùy theo mục đích sử dụng ADN, hay loại mô, đối tượng nào cần chiết suất ADN.

II. QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT DNA CHUNG

1. Chuẩn bị  mẫu:

- Đối với thực vật thường thu lấy mẫu lá, động vật thu lấy mô trên cơ thể, vi         khuẩn: nuôi vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy từ 15-16 giờ để tăng sinh., thường nuôi trong 16 giờ cho kết quả tốt nhất.

2. Phá vỡ tế bào:

- Dùng phương pháp ly tâm để phá vỡ màng tế bào và phóng thích ADN trong nhân. Riêng mẫu lá thực vật, do còn có lớp vỏ cellulose bên ngoài, nên phải được nghiền trong nitơ lỏng, giúp làm cho vách cellulose trở nên giòn hơn, dễ vỡ hơn, đồng thời bảo vệ ADN phóng thích từ nhân không bị tiêu hủy bởi các protease trong tế bào. Ngoài ra, màng tế bào và màng nhân còn được phá vở bằng hỗn hợp chất tẩy (SDS – sodium dodecyl sulfate, sarcosyl) và proteinase. Các DNA sẽ được giải phóng ra môi trường. Các protein liên kết với DNA cũng tự bị phân hủy.

3. Hòa tan ADN:

- Hòa tan DNA trong dung dịch đệm buffer TE (pH 8) giúp ADN không bị biến tính.

4. Loại bỏ  các thành phần không phải là  ADN:

- Proteinase K: loại bỏ thành phần protein.

- CTAB: loại bỏ polysaccharide và lipid.

- Chloroform: phân tách và kéo các thành phần không phải là DNA xuống mặt dưới  dung dịch.

5. Tủa ADN:

- Sử dụng ethanol 96% hoặc isoproanol ủ ở – 200C để tủa DNA trong dung dịch. Mục đích là thu nhận nucleic acid dưới dạng cô đặc và bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme.

6. Rửa DNA:

- DNA được rửa lại bằng ethanol 70% để loại bỏ các muối và các dấu vết isopropanol.

7. Làm khô:

- DNA sau khi rửa được làm khô bằng cách phơi ở nhiệt độ phòng qua đêm hay sấy khô. Mục đích tránh mẫu DNA còn chứa ethanol sẽ ảnh hưởng đến DNA tổng số.

6. Trữ  DNA:

– Trữ ADN ở - 200C giúp ADN không bị biến tính.

BÀI 1: QUI TRÌNH TRÍCH DNA TỪ THỰC VẬT

Lá chanh Von ka

I. VẬT LIỆU- HÓA CHẤT

1. Vật liệu sinh học:
Lá chanh Vonka.

2. Hóa chất:
Nitơ lỏng.

Cồn 70o

EDTA.

Agarose.

Ethidium bromide.

Isopropanol.

SDS 10%.

Chloroform.

Isoamyl alcohol.

Ethanol 96% và 70%.

Nước cất.

Dung dịch trích (Extraction buffer): 0.1M Tris.HCl  (pH 8); 0.5M NaCl, 0.05M EDTA pH 8; 0.01% β-mercaptho ethanol.

CTAB buffer: 0.02M Tris.HCl pH 7.5; 2M NaCl, 0.05M EDTA.

TE 0.1 buffer (10mM Tris pH 8, 0.1mM EDTA pH 8, chloroform/isoamylalcohol (24:1), ARNase (10 mg/ml).

3. Dụng cụ – Thiết bị
Micropipet.

Máy li tâm.

Bộ điện di minisub gel.

Agarose.

Túp Eppendorf 1,5 ml, 2,0 ml.

Kéo cắt mẫu, chày và cối nghiền mẫu.

II. NGUYÊN TẮC
Tế bào thực vật được nghiền vỡ trong điều kiện làm lạnh làm cho DNA được hòa tan vào trong dung dịch. SDS được thêm vào giúp DNA dễ hòa tan hơn.

CTAB được sử dụng rộng rãi để trích DNA cho hầu hết các loài động vật, thực vật và vi sinh vật. CTAB làm cho DNA dễ hòa tan, tách polisacharide và ARN ra khỏi DNA. Protein được tách khỏi DNA bằng phenol hoặc chloroform. Trong quá trình trích DNA thực vật cần cố gắng tránh chấn động xoáy lắc mạnh, như thế có thể thu được DNA có chiều dài từ 50 – 100kb.
III. PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

1.Chuẩn bị mẫu:

Mẫu lá chanh Vonka được khử trùng bằng cồn 70o (dùng bông gòn thấm cồn và lau đều trên cả hai bề mặt lá) , dùng kéo cắt lấy phần thịt lá ở hai bên và bỏ phần gân lá ở giữa. Phần thịt lá được gói trong giấy nhôm và ngâm nitơ lỏng trong thời gian 10 phút. Sau đó, nghiền kỉ mẫu bằng cối và chày đã được khử trùng bằng cách ngâm nitơ lỏng. Trong quá trình nghiền ta thêm nitơ lỏng vào nhằm mục đích ức chế các enzym gây biến tính DNA của lá, mẫu được nghiền cho đến khi thành bột mịn.

2.Trích DNA:

Bước 1: phá vở màng tế bào và màng nhân: Chuyển phần bột mịn vào túp 2,2ml. Sau đó cho vào túp 1ml dung dịch EB có tác dụng phá vỡ màng tế bào và màng nhân. Tế bào lá được nghiền với dịch trích EB (extraction buffer) để phá vỡ màng tế bào, giải phóng các thành phần có trong tế bào ra ngoài môi trường dịch trích. Tiếp tục cho 50ml dung dịch SDS 10% vào túp có tác dụng giúp DNA dễ hòa tan hơn , sau đó lắc nhẹ túp(không lắc quá mạnh® DNA sẽ bị gãy).

Bước 2: ủ mẫu: Mẫu sau khi thêm các dung dịch EB và SDS 10% đem ủ ở nhiệt độ 65oC trong 30 phút, trong quá trình ủ khoảng 5 phút đảo nhẹ túp để trộn mẫu.

Bước 3: li tâm: Sau thời gian ủ, mẫu được đem li tâm với vận tốc 13000rpm trong 10 phút, để tách các thành phần khác nhau của tế bào.

Bước 4: tủa DNA: Li tâm xong ta hút 800ml phần dung dịch trong ở phía trên cho vào túp mới, sau đó cho 800ml dung dịch isopropanol vào túp và tiến hành ủ trong thời gian khoảng 30 phút ở -20oC để kết tủa DNA, không cho DNA biến tính, giúp tăng khả năng thu DNA. Ở điều kiện này nhiều protein và các chất khác cũng bị kết tủa cùng ADN nên trong mẫu sẽ bị lẫn tạp. Sau đó, tiến hành li tâm với vận tốc 13000rpm trong 10 phút.

Bước 5: hòa tan tủa: Li tâm xong, phần dịch trong  được bỏ vào một cái hộp mũ có chứa  nước và thu phần kết tủa. Hòa tan tủa DNA trong 400ml TE, TE giữ DNA ổn định, không bị biến tính.

Bước 6: tạo phức với CTAB: Sau khi tủa hòa tan hết ta cho thêm vào túp 400ml CTAB và ủ ở 65oC trong 15 phút, khoảng 5 phút đảo ngược ống túp để trộn đều. Phương pháp này sử dụng CTAB (Hexadecyltrimethylammoniumbromid) – một chất tẩy cation, hòa tan màng tế bào làm cho DNA dễ hòa tan hơn, biến tính protein và hình thành phức hợp với những polysaccharide, protein, polyphenol,…. CTAB có khả năng liên kết thuận nghịch với ADN và polysaccharide, cụ thể ở nồng độ muối cao (trên 1.4 M NaCl có trong đệm chiết) thì CTAB kết hợp với ADN và polysaccharide nhưng phức hợp CTAB-DNA tồn tại ở trạng thái hòa tan, trong khi đó phức CTAB-polysaccharide lại kết tủa -phức hợp  này sau đó được tách ra khỏi dung dịch tách chiết bằng hỗn hợp chloroform – isoamyl alcohol.

Bước 7: loại bỏ protein và các phức hợp: Sau đó cho thêm vào túp 800ml Chloroform/Isoamylalcohol lắc đều và li tâm với vận tốc 13000rpm trong 5 phút để loại bỏ protein, những polycaccharide và phức hợp trên. Li tâm xong dung dịch  chia ra thành 3 lớp: lớp thứ nhất là phần dịch trong ở trên cùng có chứa DNA, lớp thứ  hai là một lớp protein, lớp kế tiếp có chứa chloroform và tất cả những thành phần cần loại bỏ khác (polysaccharides, protein,…).

Bước 8: tủa DNA: Sau khi ly tâm ta tiến hành hút 500ml phần dịch trong ở phía trên cho qua một túp 2,2ml mới, thêm vào túp này 1ml Ethanol 96% ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 15 phút để tủa DNA và bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme. Sau đó, li tâm ở 13000rpm trong 10 phút. Ethanol 96% được sử dụng kết hợp với muối để tránh gây hại cho DNA.

Bước 9: rửa DNA: Li tâm xong đổ bỏ phần dịch trong ở phía trên vào hộp mũ có chứa nước, thu lấy phần kết tủa ở phía dưới. Sau đó, tiến hành rửa kết tủa với ethanol 70% để loại bỏ muối ra khỏi DNA. Phần kết tủa được rửa 2 lần với ethanol 70% (không gây hại cho DNA do ở nồng độ thấp). Mỗi lần rửa cho 400ml ethanol 70% vào túp, lắc nhẹ và đem li tâm trong 5 phút với vận tốc 13000rpm, sau đó loại bỏ ethanol.

Bước 10: phơi khô DNA: Sau khi loại bỏ ethanol, ta tiến hành phơi khô DNA qua đêm ở nhiệt độ phòng, tránh trường hợp mẫu DNA còn chứa ethanol sẽ ảnh hưởng đến DNA tổng số, dẫn đến ảnh hưởng đến kết quả của các thao tác sau..

Bước 11: hòa tan DNA: DNA sau khi phơi khô, được hòa tan trong 50ml nước.

Sau đó, tiến hành pha loãng dung dịch DNA trên: hút 90ml nước cho vào một túp 1,5ml mới, sau đó hút 10ml dung dịch DNA cho vào túp chứa 90ml nước, lắc nhẹ. Túp 1,5ml này được đem đi đo OD.

Dung dịch DNA còn lại trong túp 2,2ml là 40ml được dùng để chạy điện di.

3. Kiểm tra chất lượng DNA:

3.1. Quá trình chạy điện di:

Phương pháp điện di trong gel agarose là phương pháp thông dụng dùng để tách rời các đoạn nucleic có kích thước từ 200bp đến 50kb.

3.1.1.Nguyên tắc:

- Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào tính phân cực của phân tử và khả năng di chuyển về một hướng xác định khi chịu tác động của một điện trường. Trong các dung dịch kiềm và trung tính, các đại phân tử nucleic acid tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên trong điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường.

- Agarose là loại polyme tách từ rong biển, được cấu tạo bởi 2 monome là             D-galactose và 3,6-anhydro L-galactose, nên sau khi đun sôi sẽ tạo thành mạng lưới cho phép các phân tử khác nhau đi qua tuỳ theo kích thước và trọng lượng phân tử.
- Các đoạn DNA kích thước khác nhau sẽ chạy với tốc độ khác nhau trên gel: đoạn ngắn chạy xa, đoạn dài chạy chậm. ADN tổng số có kích thước lớn nhất nên chạy chậm và

chiếm vị trí lớn nhất trên bản gel.
3.1.2.Quy trình điện di:

+ Chuẩn bị gel:

Khay điện di được đặt lược sẳn ở một đầu khay. Sử dụng lược có số răng là 17. Khay được đặt ở nơi bằng phẳng.

Gel sử dụng chạy điện di lá:  40ml với nồng độ 0,8% agrarose.

Trước tiên cân 0,32g agrarose cho vào chai thủy tinh, sau đó cho vào chai 50ml Bufer TE, trừ hao trong quá trình nấu bốc hơi hết 10ml. Lắc chai cho agrarose hòa tan vào Buffer TE, sau đó đem nấu trong microwave trong 2 phút ở 450W (nấu cho agrarose hòa tan hoàn toàn và trong như nuớc), agrarose sau khi nấu xong để nguội khoảng 60oC rồi đổ nhẹ dung dịch vào một đầu khay dung dịch sẽ tự trải đều khay. Khoảng 45 phút sau gel đặc lại, ta dùng tay lấy lược ra nhưng phải cẩn thận tránh bị bể gel.

Đặt khay vào bể điện di, thêm dung dịch điện di phủ mặt gel khoảng 2mm.

Sau khi gel chuẩn bị xong, ta tiến hành load mẫu vào các giếng của gel

+ Load mẫu:

Đầu tiên hút dung dịch loading buffer (một dung dịch tải DNA chứa 30% glycerol, 0,25% bromophenol blue (BPB) và 0,25% xylencyanol (XC), trong thành phần có chứa glycerol có tỷ trọng cao sẽ kéo DNA nằm trong giếng không bị trôi ra ngoài trong khi load mẫu) và nhỏ thành từng giọt nhỏ khoảng 2ml ra giấy paraflim, sau đó hút 10ml dung dịch mẫu trộn điều với dung dịch loading buffer và tiến hành load mẫu vào giếng của gel. Bắt đầu load từ giếng thứ 2, giếng thứ nhất dùng để load thang chuẩn.

Sau khi load xong ta đậy nấp bể điện di lại và tiến hành chạy điện di ở 25V. Thời gian điện di thay đổi phụ thuộc vào độ lớn của DNA, nồng độ agarose của gel và cường độ dòng điện. Sau khi chạy điện di xong bản gel được lấy nhẹ ra khỏi khuôn gel và ngâm vào dung dịch EtBr trong thời gian 30 phút có tác dụng đánh dấu phân tử DNA, hóa chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của nucleic acid và sẽ phát huỳnh quang dưới tác dụng

của tia tử ngoại. Sau đó rửa sạch bản gel bằng nước cất.

Quan sát và chụp hình: Bản gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại                      λ = 260-360 nm  trên bộ đọc gel bio-rad. Quan sát thấy ADN hiện lên dưới dạng các vạch sáng.

3.1.3.Kết quả chạy điện di:

10

RNA

Hình 1. Hình gel chạy điện di mẫu lá chanh Vonka

Mẫu ở giếng số 10, ở phía trên đầu giếng  có đốm trắng chứng tỏ DNA còn nhiễm muối do muối còn sót lại trong quá trình rửa DNA bằng cồn ethanol 70%. Trong giếng xuất hiện những vệt sáng chạy dài  là do DNA bị gãy do trong quá trình trích DNA ta lắc mạnh gẫn đến gãy DNA. Đốm sáng ở phía dưới cùng là RNA do RNA có trọng lượng phân tử nhỏ hơn DNA nên chạy nhanh hơn DNA.

3.2. Phương pháp đo OD:

3.2.1. Nguyên tắc:

- Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng của một chất ở một bước sóng xác định. Nucleic acid hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm do sự có mặt của base purine và pyrimidine. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm (OD260nm) của các mẫu cho phép xác định nồng độ nucleic acid trong mẫu.

.      – Đơn vị OD260nm tương ứng nồng độ 50ng/ml cho một dung dịch ADN sợi đôi.

Do đó nồng độ ADN trong mẫu được tính theo công thức sau:
CADN (ng/ml) = OD260nm * 50 * Độ pha loãng

- Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD ở 280 nm (OD280nm).Ở bước sóng này, các protein có mức hấp thụ cao nhất. Ngoài ra, các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm như các nucleic acid và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic acid. Một dung dịch nucleic acid được xem là sạch (không tạp nhiễm protein) khi tỷ số :

OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1.8 – 2

3.2.2 Các bước đo OD:

- Lấy 100ml nước khử ion vô trùng vào cuvet 100ml, đo đối chứng.
- Hoà 10ml dịch ADN cần đo vào 90ml nước khử ion vô trùng, bơm vào cuvet,

đo ở bước sóng 260nm, 280nm

- Đọc độ hấp thụ trên máy đo quang phổ ở bước sóng 260 nm, 280 nm. Xử lý số liệu theo công thức trên.

3.2.3. Kết quả đo OD:

Sau đây là bảng thể hiện kết quả đo OD của mẫu lá chanh Vonka:

260nm 280nm 260/280 280/260
3,0291 2,9259 1,0353 0,9659

Ta có: OD260nm = 1 Þ DNA = 50ng/ml

Qua kết quả đo OD của lá chanh Vonka ta có: OD260nm = 3,0291

Trước khi tiến hành đo OD, mẫu đã được pha loãng 10 lần. Vậy nồng độ DNA trong mẫu lá chanh Vonka thu được:

CDNA= OD260nm * 50ng/ml*10 = 3,0291*50ng/ml*10 = 1514,55ng/ml.

Qua kết quả ta thấy nồng độ DNA trong mẫu thu được là rất cao. Nhưng tỉ lệ 260/280 = 1,0353 < 1,8 chứng tỏ lượng DNA thu được này là DNA dơ, do bị nhiễm một lượng protein. Mẫu bị nhiễm là do: ở giai đoạn mẫu sau khi li tâm bị tách ra thành 3 lớp, một lớp dịch trong rồi tới một lớp protein và cuối cùng là lớp có chứa chloroform; sau đó hút phần dịch trong ở phía trên cho qua một túp mới, nhưng trong thao tác này chúng ta đã để đầu côn chạm đến màng protein hay làm vở màng protein nên đã có một lượng protein nhiễm vào mẫu DNA. Hay do trong quá trình tủa DNA bằng isopropanol ở -20oC protein cũng tủa theo làm cho mẫu DNA bị nhiễm protein.

BÀI 2: KỸ THUẬT PCR

* Mục đích: Xác định tính trạng thơm của lúa.

1. Nguyên tắc của phản ứng PCR:

PCR là kỹ thuật xử lý in vitro các chuỗi mã hóa di truyền DNA bằng cách phát triển primer một cách đồng loạt trên các dây đơn DNA. Toàn bộ tiến trình được hoàn thiện do sự biến chất của DNA cần thiết, sự tác động của primer tại đầu của các dây đơn DNA này, kế đến là sự phát triển của các primer do phản ứng DNA polymerase.
1.1.Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 giai đoạn:

- Thời kỳ biến chất DNA: tách dây đôi thành dây đơn, nhiệt độ được thiết kế là 950C, với nhiệt độ này DNA sẽ tạo ra sợi đơn DNA, hoạt động như dây nền cho quá trình

tổng hợp DNA mới.

- Thời kỳ lai giữa primer và DNA: Nhiệt độ hay đổi trong khoảng 50 – 600C. Nhiệt độ này tùy thuộc vào loại marker mà chúng ta đang sử dụng, với chiều dài cụ thể của oligonucleotide. Chúng ta phải thử từng bước để biết chắc chắn nhiệt độ cần được thiết kế là bao nhiêu.  Ở giai đoạn này các đoạn mồi sẽ bắt cặp với mạch đơn ADN khuôn mẫu ở vị trí bổ sung.

Đây là giai đoạn quan trọng nhất, bởi vì trong giai đoạn này, sự kiện lai DNA – DNA xảy ra. Nếu nhiệt độ quá cao, không lai được DNA. Nếu nhiệt độ quá thấp, việc lai DNA sẽ bị nhiều lỗi. Chính vì thế để thiết lập nhiệt độ cho chu kỳ PCR, người ta xác định nhiệt độ nóng chảy Tm với từng nhóm priner như sau: Tm = 4 x (G + C) + 2 x (A + T) 0C.

Trong phản ứng PCR này, chúng ta sử dụng nhiệt độ là 580C.

- Thời kỳ kéo dài dây DNA mới nhờ Tap polymerase: ở nhiệt độ 720C là nhiệt độ tối ưu cho những hoạt động của ADN polymerase. Dưới sự xúc tác của ADN polymerase

những đoạn mồi đã bắt cặp với ADN khuôn mẫu sẽ được kéo dài.
Các đoạn ADN mới được hình thành lại được sử dụng làm khuôn để tổng hợp cho

các chu kỳ tiếp theo.

Như vậy số lượng bản sao sẽ tăng gấp 2 sau mỗi chu kỳ và sau n chu kỳ, tính theo lý thuyết số lượng bản sao là 2n

1.2.Phản ứng PCR yêu cầu:

- ADN khuôn mẫu.
- Hai đoạn mồi đặc hiệu có chiều dài từ 15 – 30 nucleotit.

+ Primer xuôi: Bắt cặp với mạch khuôn của DNA và sẽ kéo dài theo chiều phiên mã.

+ Primer ngược: Bắt cặp với mạch mã của DNA và sẻ kéo dài ngược theo chiều phiên mã.
- Bốn loại deoxyribonucleotit triphosphat (dATP, dTTP, dGTP, dCTP).
- Enzym ADN polymerase chịu nhiệt.

- MgCl2.

- Dung dịch đệm.

2. Thành phần cho phản ứng PCR gồm:

1.Nước cất.

2.Dung dịch đệm.

3.dNTP

4.Mồi 1: EP

5.Mồi 2: ESP

6.Mồi 3: IFAP

7.Mồi 4: INSP

8.MgCl2: 3mM

9.BSA

10.Taq-polymerase: 1U

11.DNA lúa.

3. Chương trình chạy PCR
950C – 2 min                                  bất hoạt protease và các nuclease bất lợi.
950C– 5 sec                                   giảm thời gian để bảo toàn enzym và DNA khuôn.
580C– 5sec            35 chu kỳ
720C– 5sec
720C– 5 min
100C forever.                                 Trữ mẫu sau khi hoàn thành qui trình PCR.

Sau khi phản ứng kết thúc, lấy 10ml sản phẩm PCR điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5%.

4. Phương pháp:

Mỗi nhóm thực hiện 6 phản ứng + 1 phản ứng phụ.

Thực hiện với 3 mẫu:

+ Một mẫu đối chứng dương: gồm 2 túp.

+ Một mẫu DNA lúa: gồm 2 túp.

+Một mẫu đối chứng âm: gồm 2 túp.

* Trước tiên ta trộn Master mix cho 7 phản ứng.

Các thành phần lần lượt được cho vào một túp theo thứ tự và hàm lượng như sau:

1.Nước cất.                                         42ml

2.Dung dịch đệm.                                17,5ml

3.dNTPs                                              28ml

4.Mồi 1: EP                                         14ml

5.Mồi 2: ESP                                       14ml

6.Mồi 3: IFAP                                     14ml

7.Mồi 4: INSP                                     14ml

8.MgCl2: 3mM                                    21ml

9.BSA                                                 1,75ml

10.Taq-polymerase: 1U                       1,75ml

Sau khi cho đủ các thành phần vào, ta lắc đều cho hỗn hợp hòa lẫn vào nhau. Sau đó, hút vào 6 túp nhỏ (6 túp này được đặt trong nước đá) mỗi túp 24ml dung dịch Master mix.

+ 2 túp sử dụng cho đối chứng dương.

+ 2 túp sử dụng cho DNA lúa.

+ 2 túp sử dụng cho đối chứng âm.

Ở 2 túp đối chứng dương ta cho vào mỗi túp 1ml mẫu đối chứng dương, ở 2 túp DNA cho vào mỗi túp 1ml DNA lúa, ở 2 túp đối chứng âm cho vào mỗi túp 1ml nước cất. Các túp này được để trong nước đá.

Sau khi cho đầy đủ các mẫu đối chứng vào các túp ta tiến hành chạy PCR và chạy điện di các mẫu.

5.Quá trình điện di trên gel agrarose:

Phương pháp điện di trong gel agarose là phương pháp thông dụng dùng để tách rời các đoạn nucleic có kích thước từ 200bp đến 50kb.

5.1.Nguyên tắc:

- Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào tính phân cực của phân tử và khả năng di chuyển về một hướng xác định khi chịu tác động của một điện trường. Trong các dung dịch kiềm và trung tính, các đại phân tử nucleic acid tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên trong điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường

- Agarose là loại polyme tách từ rong biển, được cấu tạo bởi 2 monome là             D-galactose và 3,6-anhydro L-galactose, nên sau khi đun sôi sẽ tạo thành mạng lưới cho phép các phân tử khác nhau đi qua tuỳ theo kích thước và trọng lượng phân tử
- Các đoạn DNA kích thước khác nhau sẽ chạy với tốc độ khác nhau trên gel: đoạn ngắn chạy xa, đoạn dài chạy chậm. ADN tổng số có kích thước lớn nhất nên chạy chậm và chiếm vị trí lớn nhất trên bản gel

5.2.Quy trình điện di:

+ Chuẩn bị gel:

Khay điện di được đặt lược sẳn ở một đầu khay. Sử dụng lược có số răng là 17. Khay được đặt ở nơi bằng phẳng.

Gel sử dụng chạy điện di :  40ml với nồng độ 1,5% agrarose.

Trước tiên cân 0,6g agrarose cho vào chai thủy tinh, sau đó cho vào chai 50ml Bufer TE, trừ hao trong quá trình nấu bốc hơi hết 10ml. Lắc chai cho agrarose hòa tan vào Buffer TE, sau đó đem nấu trong microwave trong 2 phút ở 450W (nấu cho agrarose hòa tan hoàn toàn và trong như nuớc), agrarose sau khi nấu xong để nguội khoảng 60oC rồi đổ nhẹ dung dịch vào một đầu khay dung dịch sẽ tự trải đều khay. Khoảng 45 phút sau gel đặc lại, ta dùng tay lấy lược ra nhưng phải cẩn thận tránh bị bể gel.

Đặt khay vào bể điện di, thêm dung dịch điện di phủ mặt gel khoảng 2mm.

Sau khi gel chuẩn bị xong, ta tiến hành load mẫu vào các giếng của gel

+ Load mẫu:

Đầu tiên hút dung dịch loading buffer (một dung dịch tải DNA chứa 30% glycerol, 0,25% bromophenol blue (BPB) và 0,25% xylencyanol (XC), trong thành phần có chứa glycerol có tỷ trọng cao sẽ kéo DNA nằm trong giếng không bị trôi ra ngoài trong khi load mẫu) và nhỏ thành từng giọt nhỏ khoảng 2ml ra giấy paraflim, sau đó hút 10ml dung dịch mẫu đối chứng dương trộn điều với dung dịch loading buffer và tiến hành load mẫu vào giếng của gel. Bắt đầu load từ giếng thứ 2, giếng thứ nhất dùng để load thang chuẩn. Tiếp tục load mẫu DNA lúa vào giếng kế tiếp và mẫu đối chứng âm load sau cùng.

Sau khi load xong ta đậy nấp bể điện di lại và tiến hành chạy điện di ở 25V. Thời gian điện di thay đổi phụ thuộc vào độ lớn của DNA, nồng độ agarose của gel và cường độ dòng điện. Sau khi chạy điện di xong bản gel được lấy nhẹ ra khỏi khuôn gel và ngâm vào dung dịch EtBr trong thời gian 30 phút có tác dụng đánh dấu phân tử DNA, hóa chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của nucleic acid và sẽ phát huỳnh quang dưới tác dụng

của tia tử ngoại. Sau đó rửa sạch bản gel bằng nước cất.

Quan sát và chụp hình: Bản gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại                       λ = 260 – 360 nm trên bộ đọc gel bio-rad. Quan sát thấy ADN hiện lên dưới dạng các vạch sáng.

5.3.Kết quả:

8   9   10

Đối chứng dương          DNA lúa       Đối chứng âm

Hình 2. Hình gel chạy điện di mẫu DNA lúa thơm

Trên gel điện di, ta thấy giếng 8  có 2 band, cả 2 band điều thấy rỏ      mẫu ADN lúa  là  mẫu  lúa  thơm  đồng hợp tử. Giếng 9 là mẫu DNA của lúa cũng thể hiện 2 band sáng, nhìn thấy rỏ như mẫu đối chứng dương, chứng tỏ mẫu DNA lúa cũng là lúa thơm đồng hợp tử. Mẫu đối chứng âm ở giếng thứ 10 là nước cất nên không thể hiện band trên hình chụp gel.

BÀI 3: QUY TRÌNH TRÍCH DNA TỪ TÔM

I. VẬT LIỆU- HÓA CHẤT
1. Vật liệu sinh học

Mô tôm.

2. Hóa chất

Tris-HCl (pH8).

EDTA.

Cloroform.

Isoamyalcoohol.

20%SDS.

Proteinase K.

Ethanol 96% và 70%

7,5M Ammonium acetate.

Pha dung dịch: dung dịch đệm D gồm 100mM NaCl, 10mM Tris.HCl pH 8, 25mM EDTA pH 8, 0.5% SDS, 0.1mg proteinase K. Trữ ở nhiệt độ phòng. (Thêm proteinase K vào ngay trước khi sử dụng).

3. Dụng cụ – Thiết bị

Micropipet.

Máy li tâm.

Túp Eppendorf 1,5 ml, 2,0 ml

Tủ ấm.

Đũa thủy tinh.

II. PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

1. Chuẩn bị mẫu:

Tôm đem bốc bỏ vỏ ở phần lưng tôm, dùng kéo cắt một miếng thịt tôm cho vào túp 2,2ml. Sau đó, dùng đũa thủy tinh nghiền mẫu thành bột mịn.

2. Trích DNA:

Bước 1: phá vở màng tế bào: Mẫu sau khi nghiền mịn cho thêm vào túp 400ml dung dịch trích buffer D giúp phá vở màng tế bào, lắc đều và ủ qua đêm ở nhiệt độ 50oC trên máy lắc với vận tốc 500rpm.

Bước 2: loại bỏ protein và các thành phần hữu cơ: Sau khi ủ xong, ta cho thêm vào túp 400ml dung dịch Chloroform:isoamylalcohol (24:1) để để chiết xuất protein và các thành phần hữu cơ khác (polysaccharides, polyphenols, lipids,…), lắc nhẹ rồi đem ly tâm với vận tốc 13000 vòng/phút trong thời gian 10 phút. Khi li tâm xong túp phân ra thành 3 lớp, lớp thứ nhất là phần dịch trong ở trên cùng có chứa DNA, lớp thứ  hai là một lớp protein, lớp kế tiếp có chứa chloroform và các thành phần hữu cơ khác.

Bước 3: tủa DNA: Ta tiến hành hút 300ml phần dịch trong ở phía trên cho qua một túp 2,2ml mới, sau đó thêm vào túp này 200ml 7,5M ammonium acetate và 800ml ethanol 96% có tác dụng giúp DNA kết tủa, bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme và rửa sạch DNA. Lắc nhẹ và tiến hành li tâm với vận tốc 13000 vòng/phút trong 5 phút.

Bước 4: rửa DNA: Sau khi li tâm xong, ta loại bỏ phần dịch trong ở trên lấy phần cặn ở phía dưới. Rửa phần cặn với 800ml ethanol 70% 2 lần để loại bỏ muối ra khỏi DNA. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút sau mỗi lần rửa. Đổ bỏ ethanol sau mỗi lần rửa.

Bước 5: sấy khô DNA: Sấy khô bằng máy ly tâm chân không ở nhiệt độ 45oC trong 15 phút, tránh trường hợp mẫu DNA còn chứa ethanol sẽ ảnh hưởng đến DNA tổng số.

Bước 6: hòa tan DNA: Sau khi sấy mẫu xong, hút 30ml nước cất cho vào túp chứa DNA để hòa tan DNA.

Sau đó hút 10ml dung dịch này cho vào túp 1,5ml mới đã hút sẳn 90ml nước cất, lắc đều. Sau đó đem mẫu đo OD.

3. Phương pháp đo OD:

3.1.Nguyên tắc:

- Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng của một chất ở một bước sóng xác định. Nucleic acid hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm do sự có mặt của base purine và pyrimidine. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm (OD260nm) của các mẫu cho phép xác định nồng độ nucleic acid trong mẫu.

.      – Đơn vị OD260nm tương ứng nồng độ 50ng/ml cho một dung dịch ADN sợi đôi.

Do đó nồng độ ADN trong mẫu được tính theo công thức sau:
CADN (ng/ml) = OD260nm * 50 * Độ pha loãng

- Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD ở 280 nm (OD280nm).Ở bước sóng này, các protein có mức hấp thụ cao nhất. Ngoài ra, các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm như các nucleic acid và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic acid. Một dung dịch nucleic acid được xem là sạch (không tạp nhiễm protein) khi tỷ số :

OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1.8 – 2

3.2.Các bước đo OD:
- Lấy 100ml nước khử ion vô trùng vào cuvet 100ml, đo đối chứng.
- Hoà 10ml dịch ADN cần đo vào 90ml nớc khử ion vô trùng, bơm vào cuvet, đo ở bước sóng 260nm, 280nm
- Đọc độ hấp thụ trên máy đo quang phổ ở bước sóng 260 nm, 280 nm. Xử lý số liệu theo công thức trên.

3.3.Kết quả đo OD:

Sau đây là bảng thể hiện kết quả đo OD của mẫu Tôm:

260nm 280nm 260/280 280/260
1,8202 0,9305 1,9561 0,5112

Ta có: OD260nm = 1 Þ DNA = 50ng/ml

Qua kết quả đo OD của Tôm ta có: OD260nm = 1,8202

Trước khi tiến hành đo OD, mẫu đã được pha loãng 10 lần. Vậy nồng độ DNA trong mẫu Tôm thu được:

CDNA= OD260nm * 50ng/ml*10 = 1,8202*50ng/ml*10 = 910,1ng/ml.

Qua kết quả ta thấy nồng độ DNA trong mẫu thu được là tương đối. Nhưng tỉ lệ 260/280 = 1,9561 nằm trong khoảng 1,8 – 2 chứng tỏ lượng DNA thu được này là DNA sạch.

BÀI 4: TRÍCH DNA TỪ VI KHUẨN GRAM ÂM

I. VẬT LIỆU- HÓA CHẤT
1. Vật liệu sinh học
Vi khuẩn Escherichia coli
2. Hóa chất
Tris-HCl (pH8).

EDTA.

Isopropanol.

10% SDS.

Chloroform.

Ethanol 96% và 70%.

Proteinase K.

3. Dụng cụ – Thiết bị
Micropipet.

Máy li tâm.

Eppendorf 1,5ml và 2ml.
II. NGUYÊN TẮC

Việc thu nhận DNA từ tế bào vi khuẩn được tiến hành thông qua nhiều bước. Các giai đoạn cơ bản của tách chiết DNA bao gồm: (1) Phá màng tế bào và màng nhân, (2) Loại protein, (3) Tủa DNA.

Tách chiết DNA

Tế bào vi khuẩn được hòa tan vào dung dịch SDS và proteinase K.

+ Proteinase K là một serine protease không đặc biệt, được sử dụng để chiết xuất và tinh sạch DNA có trọng lượng phân tử cao, ngoài ra proteinase K cũng được dùng để chiết xuất ARNase và làm bất hoạt nuclase (ARNase và ADNase). Để hoạt động có hiệu quả hơn Proteinase K thường được duy trì trong sự hiện diện của SDS, EDTA và ure.

Để tách protein ra khỏi DNA, phenol hoặc chloroform đã được sử dụng cho mục

đích này.

III. PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

1.Chuẩn bị mẫu:

Vi khuẩn Ecoli được nuôi qua đêm.

2. Trích DNA:

Bước 1: loại bỏ các thành phần tạp nhiễm: Cho vào 2 túp (2,2ml) mỗi túp 2ml dung dịch vi khuẩn Ecoli đã được nuôi cấy qua đêm. Sau đó, li tâm ở 13000rpm trong 5 phút. Li tâm xong loại bỏ phần trong lấy phần tủa phía dưới.

Bước 2: hòa tan DNA: Bơm 250ml TE vào túp thứ nhất để hòa tan kết tủa ở túp thứ nhất, sau đó chuyển phần dung dịch ở túp thứ nhất sang túp thứ hai, hòa tan DNA ở túp thứ hai.

Bước 3: chiết xuất DNA: Sau đó, cho thêm vào túp 50ml dung dịch 10% SDS cộng 5ml Proteinase K lắc đều, ủ 20 phút ở nhiệt độ 65oC, mỗi 5 phút đảo ngược túp một lần để trộn đều dung dịch, có tác dụng phá vỡ màng tế bào và màng nhân, chiết xuất và tinh sạch DNA.

Bước 4: tạo phức với CTAB: Sau khi hòa tan hết tủa ta cho thêm vào túp 400ml CTAB và ủ ở 65oC trong 20 phút, khoảng 5 phút đảo ngược ống túp để trộn đều. Phương pháp này sử dụng CTAB (Hexadecyltrimethylammoniumbromid) – một chất tẩy cation, hòa tan màng tế bào làm cho DNA dễ hòa tan hơn, biến tính protein và hình thành phức hợp với những polysaccharide, protein, polyphenol,…. CTAB có khả năng liên kết thuận nghịch với ADN và polysaccharide, cụ thể ở nồng độ muối cao (trên 1.4 M NaCl có trong đệm chiết) thì CTAB kết hợp với ADN và polysaccharide nhưng phức hợp CTAB-ADN tồn tại ở trạng thái hòa tan, trong khi đó phức CTAB-polysaccharide lại kết tủa -phức hợp  này sau đó được tách ra khỏi dung dịch tách chiết bằng hỗn hợp chloroform – isoamyl alcohol.

Bước 5: loại bỏ protein và các phức hợp: Tiếp tục thêm 600ml chloroform:isoamylalcohol (24/1), lắc đều và li tâm ở 13000 vòng trong 10 phút để loại bỏ protein, những polysaccharide và các phức hợp trên.

Bước 6: tủa DNA: Li tâm xong, chuyển 500ml  phần trong ở phía trên vào túp mới và thêm 1ml isopropanol lắc đều, giữ ở – 20oC trong 30 phút nhằm mục đích tủa DNA, không cho DNA biến tính, thu được DNA nhiều hơn và bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme. Tiến hành li tâm ở 13000 vòng trong 10 phút để tập trung lượng DNA kết tủa xuống đáy túp.

Bước 7: loại bỏ phần dịch trong: Sau khi li tâm, ta loại bỏ phần dịch trong ở phía trên và thu phần kết tủa ở phía dưới.

Bước 8: rửa tủa: Rửa tủa với 1ml ethanol 70% ly tâm ở 13000rpm trong 5 phút, làm 2 lần để loại bỏ muối bám trong DNA và loại bỏ lượng isopropanol còn lại trong DNA (mỗi lần đổ bỏ ethanol).

Bước 9: phơi khô DNA: Rửa DNA xong, ta tiến hành phơi DNA qua đêm ở nhiệt độ phòng cho sạch hết ethanol tránh ảnh hưởng đến DNA tổng số.

Sau đó, cho vào túp 100ml nước cất, lắc đều cho DNA tan ra và tiến hành đo OD.

3.Phương pháp đo OD:

3.1.Nguyên tắc:

- Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng của một chất ở một bước sóng xác định. Nucleic acid hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm do sự có mặt của base purine và pyrimidine. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm (OD260nm) của các mẫu cho phép xác định nồng độ nucleic acid trong mẫu.

.      – Đơn vị OD260nm tương ứng nồng độ 50ng/ml cho một dung dịch ADN sợi đôi.

Do đó nồng độ ADN trong mẫu được tính theo công thức sau:
CADN (ng/ml) = OD260nm * 50 * Độ pha loãng

- Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD ở 280 nm (OD280nm).Ở bước sóng này, các protein có mức hấp thụ cao nhất. Ngoài ra, các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm như các nucleic acid và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic acid. Một dung dịch nucleic acid được xem là sạch (không tạp nhiễm protein) khi tỷ số :

OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1.8 – 2

3.2.Các bước đo OD:

- Lấy 100ml nước khử ion vô trùng vào cuvet 100ml, đo đối chứng.
- Hoà ADN cần đo vào 100ml nước khử ion vô trùng, bơm vào cuvet, đo ở bước sóng 260nm, 280nm

- Đọc độ hấp thụ trên máy đo quang phổ ở bước sóng 260 nm, 280 nm. Xử lý số liệu theo công thức trên

3.3.Kết quả đo OD:

Sau đây là bảng thể hiện kết quả đo OD của mẫu vi khuẩn Ecoli:

260nm 280nm 260/280 280/260
0,1140 0,0555 2,0524 0,4872

Ta có: OD260nm = 1 Þ DNA = 50ng/ml

Qua kết quả đo OD Tôm ta có: OD260nm = 0,1140

Trước khi tiến hành đo OD, mẫu vi khuẩn không tiến hành pha loãng 10 lần. Vậy nồng độ DNA trong mẫu vi khuẩn Ecoli thu được:

CDNA= OD260nm * 50ng/ml = 0,1140*50ng/ml= 5,7ng/ml.

Qua kết quả ta thấy nồng độ DNA trong mẫu thu được mặc dù là rất thấp nhưng qua tỉ lệ 260/280 = 2,0524 nằm trong khoảng 1,8 – 2 chứng tỏ lượng DNA thu được này là DNA sạch.

Câu hỏi

1. Chúng ta có thể sử dụng kính hiển vi để thấy DNA đã trích không?

Ta chỉ thấy là một khối đồng nhất acid nucleotid vì kích thước chuỗi polypeptide rất nhỏ nên không thể nhìn bằng kính hiển vi thông thường.

2. Phương pháp trích DNA hữu dụng như thế nào đối với người nghiên cứu?

Trích ADN giúp xác định được trình tự các nucleotid trên các gen, từ đó xác định được các tính trạng ứng dụng trong chọn giống cây trồng, sản xuất vaccin phòng và trị một số bệnh di truyền ở động vật, người …

Kiểu gen có tính di truyền phản ánh mối quan hệ  huyết thống trong chủng tộc, gia đình, xác định được chính xác cá thể rất hữu dụng trong công tác nhân diện nhân thân.

3. Theo bạn số lượng nhiễm sắc thể có ảnh hưởng đến khối lượng DNA thu hoạch được sau khi li trích không?

Có  ảnh hưởng, vì ADN nằm trên nhiễm sắc thể nên số lượng nhiễm sắc thể tỉ lệ thuận với khối lượng ADN.

4. Qui trình trích DNA của lá bưởi bạn đang sử dụng có thể dùng trích DNA của lá lúa không?

Nhìn chung bộ gen của các loài thực vật không khác nhau nhiều về cấu trúc, nên chúng ta có thể dùng quy trình tách chiết ADN lá cây họ cam,quýt cho cây lúa mặc dù quy trình không được tối ưu hoàn toàn cho loại cây đó.

BÀI TẬP

Bài tập1: Pha 100ml dung dịch EB (0.1M Tris.HCl pH 8; 0.5M NaCl, 0.05M EDTA pH 8; 0.01% β-mercaptho ethanol) từ các dung dịch gốc Tris.HCl 1M, NaCl 5M, EDTA 0.5M; β-mercaptho ethanol 100%. Phải mất bao nhiêu dung dịch gốc để pha dung dịch EB.

Dựa vào công thức C1V1=C2V2 ta tính được các thể tích các dung dịch gốc cần pha như sau: V1 = C2V2 / C1

* VTris.HCl = 0.1*100/1 =10 ml

* VNaCl = 0.5*100/5 = 10ml

* VEDTA = 0.05*100/0.5 = 10ml

* V β-mercaptho ethanol = 0.01%*100/100% =  0.01ml

Tổng thể tích của dung dịch gốc = 10 + 10 + 10 +0.01 = 30.01ml

Þ Thể tích nước cất thêm vào = 100 – 30.01 =  69.99 ml

Bài tập 2: Điền vào tất cả các ô trống trong bản sau đây. Cho biết mạch nào là mạch mã, mạch nào là mạch khuôn. Ghi đầu 5’ và 3’ của DNA và đầu NH2, COOH của protein.

Phân tử Đầu Trình tự Đầu

ADN

Mạch: khuôn

3’ C G T T T G A C T G C A 5’
Mạch:

5’ G C A A A C T G A C G T 3’
mARN

5’ G C A A A C U G A C G U 3’
Anticodon của tARN

5’ U G C G U U U C A A C G 3’
Acid amin

H2N Ala N Stop Arg COOH

Anticodon và codon bắt cặp bổ sung theo hình thức đối song song

Thí dụ: 5’ AUG 3’ thì anticodon phải là 3’ UAC 5’

Bài tập 3: Điền vào tất cả các ô trống trong bản sau đây. Cho biết mạch nào là mạch mã, mạch nào là mạch khuôn. Ghi đầu 5’ và 3’ của DNA và đầu NH2, COOH của protein.

Phân tử Đầu Trình tự Đầu

ADN

Mạch: khuôn

3’ T A C T T G A C T G C A 5’
Mạch:

5’ A T G A A C T G A C G T 3’
mARN

5’ A U G A A C U G A C G U 3’
Anticodon của tARN 5’ C A U G U U U C A A C G 3’
Acid amin

H2N Met N Stop Arg COOH

About these ads

Leave a Reply

Fill in your details below or click an icon to log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Log Out / Change )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Log Out / Change )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Log Out / Change )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Log Out / Change )

Connecting to %s